서론
Cryo-EM (Cryo-electron microscopy)은 지난 10년간 구조생물학에서 가장 급격한 기술 혁신을 이룬 분야 중 하나이다. 직접 전자 감지 기술(Direct electron detection, DED)의 도입은 Cryo-EM의 해상도 혁명을 촉발시켰다.[1] 기존의 CCD 기반 기록 장치는 방사선 손상을 줄이기 위해 낮은 전자선량(Electron dose)으로 촬영해야 했고, 이로 인해 심각한 신호대잡음비(Signal-to-noise ratio, SNR) 저하를 초래했다. 반면, DED는 높은 감도와 빠른 프레임 수집 기능을 제공함으로써 motion correction을 가능하게 하고, 결과적으로 단일입자 분석(Single-particle analysis, SPA)에서 Nyquist 한계 이상의 고해상도 구조 재구성을 가능하게 했다.[2] 이와 함께 Cryo-EM에서 전자빔 유도 이동 (Beam-induced motion, BIM) 보정은 필수적 기술로 자리 잡았다. BIM은 전자빔 조사 시 grid 표면과 시료층이 물리적으로 이동하면서 영상 흐림(Image blurring)을 일으키는 현상으로, 시료가 hole 가장자리에서 더 큰 이동성을 보이며, 이것이 구조 왜곡의 핵심 원인임을 실험적으로 입증되었다.[3] 이러한 문제는 Motion correction 알고리즘의 발전에 따라 상당 부분 해결되었지만, grid 재료나 얼음 막 두께 등에 따라 여전히 해상도 저하 요인이 된다. 이러한 기술 발전은 Cryo-EM의 전반적인 해상도 향상으로 이어졌고, 소위 “해상도 혁명 (Resolution revolution)”이라는 전환기를 열었다. 2013년 이후, 직접전자감지기술, 고정밀 정합 알고리즘, 3차원 분류 및 정렬 기술의 도입으로 인해, 기존의 6-8 Å 수준의 Cryo-EM 구조는 3-4 Å 수준으로 향상되었으며, 최근에는 apoferritin, aldolase 등 기준 단백질을 대상으로 한 분석에서 1.5 Å 내외의 준원자 해상도(Sub-atomic resolution)도 보고되고 있다.[4] 이러한 발전은 단순히 검출기의 성능 향상뿐 아니라, specimen preparation 과정에서의 grid 재료, 얼음 두께, 시료 안정성 등 물리적 변수의 정밀 제어에 의해 가능해졌으며, 고해상도 구조 규명의 필수 조건으로 자리 잡았다.
Cryo-EM의 발전은 약물개발(Drug discovery)과 구조기반 설계(Structure-based design) 분야에서도 혁명적 변화를 일으켰다. 특히 GPCR, 이온채널, 멀티머 단백질 복합체(Multimeric complexes) 등, 결정화가 어려운 막단백질 및 대형 복합체 타겟에 대해, 고해상도 구조가 Cryo-EM을 통해 최초로 규명되기 시작했다.[5,6] 이러한 연구들은 전통적 X선 결정학 접근을 뛰어넘어, 생리적 환경과 유사한 조건에서 단백질의 활성 상태를 포착할 수 있다는 점에서도 큰 의의를 가진다.
Fig. 1은 단백질 Cryo-EM specimen preparation에 사용되는 grid의 계층적 구조를 도식화한 것이다. 전체 grid는 보통 직경 3 mm의 원형 금속 프레임으로 구성되며, 내부에는 정사각형 패턴으로 배치된 mesh 구조가 기계적 지지력을 제공한다. 이 mesh 위에는 전자 투과성 지지막(Support foil)이 부착되며, 해당 foil은 일반적으로 비정질 탄소(Amorphous carbon), 그래핀(Graphene), 또는 금(Gold)과 같은 재료로 구성된다. 지지막에는 규칙적인 미세 구멍(Perforated holes)이 배열되어 있으며, 그 위에 형성된 얇은 비정질 얼음 층 (Vitreous ice) 내에 단백질 입자가 고르게 분포된다. 이러한 상태에서 시료는 전자현미경을 통해 직접 관찰된다. Grid의 각 구조적 계층은 시료 안정성, 얼음 두께, 입자 방향 분포(Particle orientation), 그리고 최종 구조의 해상도 확보에 중대한 영향을 미친다. 하지만 Cryo-EM을 통해 안정적이고 고해상도의 구조를 재현하는 것은 여전히 실험적으로 까다로운 과제다. 특히 막단백질과 같이 표면 소수성이 높은 시료는 얼음층과 공기–물 계면(Air– water interface)에서 쉽게 변성되거나 파편화될 수 있다.[7] 또한 입자가 grid 표면 또는 얼음 경계층에 비 특이적으로 흡착되면서 입자 방향 분포에 편향이 생기는 orientation bias 문제 역시 빈번하게 발생한다.[8] 따라서 Cryo-EM에서 일관된 고해상도 구조를 확보하기 위해서는 고성능 검출기나 소프트웨어만으로는 충분하지 않다. Grid 재료의 선택, 표면 개질(Surface modification) 전략, 얼음막 두께의 정밀 제어, 그리고 시료 특성에 최적화된 시료 준비 프로토콜이 유기적으로 통합되어야 한다. 본 리뷰에서는 이러한 기술적 배경을 바탕으로, 최신 grid 재료의 종류와 특성, 표면 개질 기법, 얼음막 조절 기술, 그리고 특히 막단백질과 같은 복잡한 시료군에 적합한 Cryo-EM 시료 준비 전략을 중심으로 체계적으로 고찰하고자 한다.
본론
2.1 초기 Cryo-EM Grid 개발과 Holey Carbon Film의 등장
Cryo-EM의 효율적인 시료 준비는 초기부터 grid 재료의 물리적 특성에 의존해 왔다. 1970년대 초반, 수십 나노미터 두께의 비정질 탄소 필름을 이용한 ultrathin carbon grid가 개발되었으며, 이는 전자빔의 투과를 허용하면서도 시료를 안정적으로 지지할 수 있는 기반 기술로 평가되었다.[9] 해당 방식은 mica 기판 위에 carbon을 증착한 후 이를 전사하는 방식으로 제작되었으며, 전자 산란을 최소화할 수 있다는 이점이 있었지만 radiation damage에는 취약했고, 배경 신호가 높아지는 단점이 있었다.
이 문제를 보완하기 위해 carbon film 상에 규칙적인 구멍을 배열한 holey carbon film이 도입되었다. 이는 지지 면적을 줄임으로써 입자가 얇은 비정질 얼음층 내에 자유롭게 부유할 수 있도록 하여 이미지 대비를 향상시키고 배경 산란을 감소시켰다. 초기 제작 방식은 polymer 기판에 carbon을 증착한 후, 유기용제로 polymer를 용해시켜 미세 구멍을 남기는 플라스틱 복제 방법을 사용하였다. 하지만 이 방식은 표면 불균일성, 플라스틱 잔여물 문제, 그리고 hole의 비정형적 배열로 인한 입자 배치 불균형과 대비 변화 등 여러 한계를 동반하였다.
탄소 필름의 두께 조절과 증착 조건 최적화를 통해 전자빔 손상을 완화하려는 시도는 있었지만, 전자빔 조사 중에도 sp²– sp³ 결합 전이와 질량 손실이 발생하는 탄소 재료 특성상, 구조적 안정성을 완전히 확보하기는 어려웠다.[10] 특히 300 kV 전자빔 조건에서는 누적 선량이 20 e⁻/Ų 수준에 도달하면 필름의 투과율이 급격히 감소하고, beam-induced charging 현상이 강화되는 것으로 보고되었다.[3]
또한 charging으로 유도된 전기장은 마치 electrost-atic lens처럼 작용하여 입자 크기나 orientation의 체계적인 편향을 일으키는 것으로 보고되었으며, 이는 3D 재구성 시 특정 방향에 대한 oversampling 또는 undersampling을 유발한다.[3] 뿐만 아니라 이러한 정전기장은 입자의 회전 자유도를 제한하여 angular distribution bias를 심화시키는 것으로 나타났다.
Holey carbon film은 간편한 제작 공정과 낮은 비용 덕분에 수십 년간 표준 grid로 사용되어 왔지만, 4 Å 이하의 고해상도 해석이 요구되는 현대 Cryo-EM 분석에서는 방사선 저항성과 기계적 안정성 측면에서 명백한 한계를 드러낸다. 특히 전자빔 조사 동안 grid의 hole 영역에서 발생하는 drum-like deformation은 입자 회전 및 수직 변위(Perpendicular displacement)를 유발하여, 시료의 평면 내 안정성을 심각하게 저하시킨다. Drum motion에 의해 발생하는 비선형적 입자 이동은 기존 motion correction 알고리즘으로 보정하기 어려운 복합적인 artifact를 형성하며, 최종 Fourier shell correlation 기준 해상도에서 구조 품질의 저하를 야기한다.[3] 이러한 charging 효과는 단순히 입자의 이동을 초래하는 것을 넘어, 국소 전기장 렌즈 효과를 통해 입자의 크기와 방향 분포에 체계적인 편향을 야기하며, 결과적으로 resolution anisotropy를 악화시키는 결과로 이어진다.[10] 또한 얼음막 두께의 불균일성은 defocus 추정 및 Contrast transfer function (CTF) 보정 정확도를 저하시킨다. 실제로 holey carbon grid 위에서 형성된 vitreousice의 두께는 ±30 nm 수준의 차이가 존재할 경우, FSC 0.143 기준 해상도가 0.6–0.8 Å 감소하는 경향이 확인되었다.[11] 이러한 현상은 특히 50–100 kDa의 소형 단백질에서 더 큰 영향을 미친다. 이외에도 hole edge 근방에서 radiation-induced beam broadening이 촉진되어 입자 주변에 과도한 전자 선량이 집중되고, 이로 인해 단백질의 구조적 안정성이 손상되며 영상의 신호대잡음비가 전반적으로 저하된다.[10]
2.2 Ultrathin Continuous Carbon Film의 활용과 한계
초기 Cryo-EM 시료 제작에서는 holey carbon grid 가 가장 널리 사용되는 지지체였지만, SPA 기반의 고해상도 구조 해석이 보편화되면서, 입자의 손실을 줄이면서도 배경 신호를 최소화할 수 있는 새로운 grid 재료의 필요성이 제기되었다. 이러한 요구에 따라 두께 3–10 nm 수준의 초박형 연속 탄소 필름(Ultrathin continuous carbon film)이 개발되어, 시료 밀도가 낮은 경우나 분자량이 작은 단백질 분석 시 specimen embedding efficiency를 높이는 데 기여하였다.[10]
연속 탄소막은 입자들이 얼음 내에서 부유하지 않고 지지면 위에 흡착되도록 유도함으로써 particle loss를 줄이고, 특히 AWI로의 이동을 억제해 부분적인 변성이나 응집 현상을 완화시키는 데 효과적이다. 얇은 carbon layer는 전자 투과율을 높은 수준으로 확보하면서도 충분한 물리적 지지력을 제공하여, 저분자량 단백질이나 유연한 복합체 분석에서 높은 contrast와 안정적인 입자 정렬을 가능하게 한다.[10]
하지만 이 방식은 여러 구조적⋅물리적 한계를 동반한다. 우선 방사선 손상에 취약한 점이 가장 큰 제약이다. Cryogenic 상태에서도 sp² 탄소 구조가 전자빔 조사 하에서 sp³ 구조로 변환되며, 그에 따른 질량 손실과 빠른 amorphization이 발생한다.[12] 낮은 열전도성과 제한적인 기계적 강성은 cryo-EM grid에서의 중요한 결점으로 지적된다. 전자빔 조사 시 국소적인 발열이 grid에 축적되면 grid foil에 미세한 휨(Warping)이 발생할 수 있으며, 이로 인해 얼음막 두께의 공간적 불균일성과 부분적인 dewetting 현상이 유발될 수 있다. 특히 vitrification 과정에서 냉각 속도의 국소적 불균형은 시료 재현성 저하의 주요 원인으로 작용할 수 있다.[13,14] 한편, amorphous carbon 표면은 흡착 선택성 제어가 어렵다는 구조적 제약을 가진다. 소수성이 강한 탄소 표면은 단백질의 비특이적 흡착 (Non-specific adsorption)을 유도하기 쉬우며, 이는 입자의 공간 분포 불균형을 초래하고 aggregation 또는 preferred orientation bias를 증가시키는 경향을 보인다. 특히 막단백질 또는 glycoproteins처럼 표면이 활성화된 시료에서 이러한 문제는 더 뚜렷하게 나타난다.[8,15]
그럼에도 불구하고 ultrathin carbon film은 특정 실험 조건에서 여전히 유효한 grid 선택지로 평가받는다. 예를 들어, 극도로 낮은 SNR을 갖는 작은 항체 단편이나 유연한 dynamic complex 분석에서는 흡착 기반 시각화 전략이 유리하며, ice 내에서 particle concentration을 증가시켜 이미지 수집 효율을 높일 수 있다. 특히 초기 low-dose screening 단계에서는 grid-to-grid consistency를 확보하는 데 기여할 수 있다.[10]
2.3 Gold Grid의 도입과 성능 개선
Holey carbon grid는 Cryo-EM의 초기 specimen preparation에서 중요한 기반을 제공했지만, 고해상도 구조 해석이 보편화되면서 그 물리적 한계가 명확하게 드러났다. 특히 BIM, 전하 축적(Charging artifact), 얼음막 두께 편차(Ice thickness variation) 등은 구조 왜곡 및 시료 품질 저하를 유발하는 주요 요인으로 작용하였다.[13] 이러한 문제점을 해결하기 위해 Russo와 Passmore는 금속성 기반의 UltrAu Foil grid를 개발하였다. 이 grid는 고전도도(약 4.1 × 10⁷ S/m)의 금(Gold) 소재를 전체 프레임 및 foil에 적용하여, irradiation 동안 표면에 발생하는 정전기 축적을 효과적으로 분산시키며, 동시에 기계적 안정성을 향상시킨다.[13] 또한 gold foil 전체에 미세한 구멍(Hole array)을 직접 에칭하는 방식은 기존 carbon foil에서 나타났던 열 수축 불균형을 해소함으로써 vitrification 중 grid의 물리적 안정성을 유지하는 데 기여한다.
Gold grid의 BIM 억제 효과는 실험적으로 입증되었다. 기존 carbon grid에서는 평균 5–8 Å/frame 수준의 specimen lateral displacement가 관찰되었지만, gold grid에서는 동일 조건에서 2–3 Å/frame 이하로 감소하였다.[13] 이는 SPA 분석에서 고해상도 구조 확보의 필수 조건인 particle 정렬 정확도 향상에 결정적으로 기여한다. 실제로 apoferritin 구조는 gold grid를 사용하여 1.8 Å 해상도로 재구성되었으며, 이는 당시 Cryo-EM 기술의 물리적 한계를 돌파한 사례로 평가되었다.[16]
Gold grid는 radiation resistance 측면에서도 carbon grid보다 현저히 우수하다. Gold는 누적 electron dose에서 100 e⁻/Ų 이상의 조건에서도 구조적 안정성을 유지할 수 있다.[13] 이는 특히 dose-fractionation 및 super-resolution imaging이 요구되는 데이터 수집 프로토콜에서 specimen의 구조적 보존성을 유지하는 데 핵심적인 역할을 한다.[17] 얼음막 두께의 공간적 균일성도 gold grid에서 향상된다. Russo와 Passmore는 gold grid를 사용할 경우 매우 낮은 수준의 두께 편차를 보고하였으며, 이는 기존 holey carbon grid 대비 약 2배 이상 향상된 수치로, CTF 보정 및 defocus estimation의 정밀도를 높여주는 효과가 있다.[13,18]
Hagen은 gold grid에 적용 가능한 에너지 필터에 기반의 plasmon imaging 전략을 제안하였는데, 이는 금속의 고전자 밀도 특성을 활용해 얼음막 두께에 따른 시각적 contrast를 기반으로 imaging에 적합한 영역을 빠르게 선별할 수 있게 한다.[19] Fig. 2에서 볼 수 있듯이 이 전략은 고속 자동화 work flow에서의 grid 영역 선택 최적화에 기여하며 데이터 수집 시간을 단축시킨다. 이 외에도 ultraflat gold substrates, gold-carbon hybrid grids 등 다양한 파생 기술들이 개발되고 있으며, 이들은 입자 orientation control, particle immobilization stability 측면에서 기존 기술을 보완하는 역할을 한다.[20,21]
Fig. 2.
Plasmon imaging of UltrAuFoil grid using various low magnification modes. (a) Unfiltered image, (b) Zero-loss filtered image, (c) Plasmon mode image, (d) Plasmon mode image with 40 μm selected area (SA) aperture. Insets highlight hole visibility and ice thickness contrast under each condition. Image adapted from Hagen et al. Front. Mol. Biosci.
2.4 Graphene 기반 Grid의 도입
Cryo-EM 시료 준비는 specimen support의 특성에 따라 해상도 및 시료 안정성에 직접적인 영향을 받는다. Carbon 기반 grid는 전자 투과율과 방사선 안정성 측면에서 한계를 드러내왔으며, 이러한 기술적 제약을 극복하기 위한 재료로서 graphene이 주목받고 있다. Graphene은 단일 원자층의 2차원 결정 구조로, 두께는 약 0.34 nm에 불과하지만 인장 강도는 130 GPa, 전기 전도도는 10⁶ S/cm에 달한다.[23] Chemical vapor deposition을 통해 대면적 monolayer graphene을 합성한 후, polymer-assisted transfer 방식을 이용해 grid에 전사하는 기술이 도입되었으며, 이로 인해 graphene grid는 기존 amorphous carbon film보다 높은 전자 투과성과 기계적 안정성을 동시에 제공할 수 있게 되었다.[24]
Cu(111)/sapphire 기반에서 성장시킨 ultraflat graphene (UFG)을 cryo-EM grid로 전사하여 기존 Cu foil 기반 graphene에서 흔히 관찰되던 주름(Wrinkle), step bunch, height variation 등의 문제를 최소화할 수 있음을 입증하였다. UFG는 ±1 nm 범위 내의 표면 평탄성을 유지하며, 기존 graphene foil 대비 얼음막의 두께 편차와 particle 위치 안정성 측면에서 구조 해석에 유리한 조건을 제공한다(Fig. 3). 특히, graphene은 inelastic scattering을 현저히 줄여 background noise를 감소시키고, particle SNR 을 향상시킴으로써 low-dose imaging에서도 탁월한 contrast를 보인다.[26]
Fig. 3.
Design and scalable preparation of ultraflat suspended graphene membranes.
(a) Graphene grown on copper foil, (b) Atomic Force Microscope (AFM) image and schematic showing wrinkles and step bunches, (c) Surface height comparison between graphene on copper foil and Cu(111)/sapphire wafer, (d) Graphene grown on Cu(111)/sapphire, (e) AFM image and schematic of atomically flat graphene on wafer, (f) Wafer-scale transfer of ultraflat graphene (UFG) onto EM grids, (g) Schematic and AFM image showing suspended UFG with low height variation (ΔH ≈ 2 nm), (h) Schematic and AFM image of rough suspended graphene with higher variation. Adapted from Zheng et al., Nat Methods 2023;20:515–522, with permission of Nature Portfolio.[25]
Han et al.[27]은 graphene grid를 이용해 apoferritin 단백질 복합체를 고해상도로 재구성하였고, 이는 graphene이 기존 gold 및 carbon grid를 능가할 수 있음을 입증한 대표 사례다. 또한 graphene은 100 e⁻/Ų 이상의 누적 선량에서도 구조 열화를 거의 보이지 않아 고선량 imaging이나 advanced motion correction이 필요한 work flow에서 specimen stability를 유지하는 데 유리하다.[24]
그러나 graphene 표면의 본질적 소수성(Hydr-ophobicity)은 단백질의 비흡착성(Non-adsorption)을 유발하고, particle loss 및 distribution 불균형을 초래할 수 있다. 이를 개선하기 위한 대표적인 방법이 Graphene oxide (GO) 기반 grid이며, 산화 처리된 graphene은 친수성 기(Carboxyl, Hydroxyl 등)를 표면에 도입해 단백질 친화도 및 입자 orientation 분포를 개선하는 데 효과적이었다.[15,28]
또한 최근에는 입자 표면의 다양한 결합 부위와 상호작용할 수 있는 Dual-affinity graphene (DAG), amino-functionalized graphene, 그리고 Epoxidized graphene (EGS)과 같은 고기능성 그리드 기술이 개발되었다.[26,29] 이들은 단백질의 AWI 노출을 줄이고 orientation bias를 최소화하여 3D 재구성 품질을 향상시킨다. Graphene은 구조적 유연성과 기계적 강성 모두 우수하여, vitrification 과정 중 발생하는 열적 스트레스 및 변형으로부터 specimen을 효과적으로 보호한다. 특히 얇은 얼음막 조건에서도 particle collapse를 억제하고, ice thickness uniformity를 유지함으로써 고해상도 구조 분석의 reproducibility를 개선하는 데 기여한다.[30]
2.5 Self-Wicking Nanowire Grids의 개발
Cryo-EM 시료 제작 중 blotting 과정에서 발생하는 강한 전단력은 입자 응집이나 해체를 유도할 수 있으며, 막단백질이나 고유한 결합 친화도를 가진 복합체의 경우 구조적 안정성을 심각하게 손상시킨다. 이러한 한계를 극복하기 위한 접근으로 self-wicking nano wire grid 기술이 개발되었으며, 이는 금 표면에 금속 산화물 나노와이어 배열을 형성하여 자가흡수 기능을 갖춘 grid 를 구현하는 방식이다.[31] 이 기술은 나노와이어 배열이 생성하는 모세관 현상(Capillary action)을 이용하여 grid 중앙의 액체를 주변 테두리로 빠르게 이동시키며, 수십 밀리 초 내에 잔여 용액을 제거할 수 있다. 실험적으로 self-wicking grid는 기존 holey carbon grid 대비 얼음막 두께를 제공하여 범위를 크게 개선한 것으로 나타났다.[32] 또한 blotting 과정이 생략되면서 입자의 물리적 손상이 줄어들고, particle recovery가 향상되었으며, 저농도 시료에서도 충분한 입자 밀도를 확보할 수 있었다.[31,33] 이로 인해 희귀 단백질이나 동적 복합체의 분석에도 적용 가능성이 높아졌다. 이와 함께 나노와이어 배열은 grid 표면의 열전도도를 향상시켜 irradiation 중 발생하는 국소 발열을 완화하며, radiation-induced damage 억제에 효과적이다.[34] 특히 sub-3 Å 수준의 고해상도 구조 분석에서 입자의 안정성을 보장하는 데 기여하며, advanced motion correction 및 direct detection 기술과의 병용 시 더욱 탁월한 성능을 발휘한다.
Self-wicking grid는 specimen preparation의 재현성 향상 측면에서도 주목된다. blotting 방식은 blot force, 시간, 환경 습도 등 다양한 외부 변수에 민감한 반면, self-wicking grid는 이러한 요인에 덜 민감하여 균일한 시료 제작 결과를 제공한다.[7] 이는 고속 데이터 수집과 대규모 분석을 요하는 work flow에 적합하다. 하지만 나노와이어 그리드는 제작 공정이 복잡하고 비용이 높으며, 장기 저장이나 취급 중 구조적 손상이 발생할 가능성이 존재한다. 또한 얼음 형성의 역학적 특성이 blotting 방식과 다르기 때문에, grid 종류에 따라 별도의 최적화된 freezing protocol이 필요하다. 이를 보완하기 위해 다양한 재료(ZnO, TiO₂ 등)와 표면 기능화 전략이 병행되고 있다.[31,33]
2.6 실시간 제어 기반 자동화 시료 제작 기술의 발전
Cryo-EM의 구조 해석에서 specimen preparation 은 여전히 가장 큰 병목 중 하나로 지적되며, 이 과정의 정밀도 및 재현성 향상을 위한 자동화 기술의 개발이 활발히 진행되고 있다. Koning et al. [35]은 이와 같은 문제를 해결하기 위해 Fig. 4와 같이 흡입 기반의 정밀 액적 제어 시스템과 실시간 광학 모니터링(Optical monitoring) 을 통합한 자동화 vitrification 플랫폼을 제안하였다. 해당 시스템은 grid 상에 액적을 분사한 직후, 흡입 진공을 통해 여분의 용액을 제거하고, 그 직후 plunge freezing을 수행함으로써 균일하고 얇은 vitrified ice 형성을 가능하게 했다.
Fig. 4.
Automated cryo-EM grid preparation system
(a) Overview of the Linkam plunger setup, including the liquid nitrogen container, electrical control, and tweezers holder, (b) Central unit with cryogenic chamber, environmental chamber, and glow discharge unit, viewed from above, (c) Schematic showing sample containers, liquid ethane reservoir, grid storage, tweezers lock, and glow discharge unit, with visual inspection via a built-in lens, (d) Grid box for holding up to three grids, (e) Temperature-controlled block with secure locking slots for tweezers and grid positioning, enabling suction-assisted freezing and real-time imaging. Adapted from Koning et al. Nat Commun 2022;13:2939, with permission of Nature Portfolio.[35]
이 연구는 특히 얼음막 두께의 실시간 모니터링과 흡입 압력 제어를 통한 수두 조절로 기존 blotting 기반 방식보다 reproducibility가 높고, 막단백질과 같은 구조적으로 민감한 시료군에서도 향상된 particle homogeneity와 orientation distribution을 확보할 수 있음을 실험적으로 입증하였다. 이러한 자동화 플랫폼은 향후 Cryo-EM specimen preparation work flow의 표준으로 자리잡을 가능성이 높으며, 고속 데이터 수집 및 대규모 구조분석 프로젝트의 효율성을 극대화할 수 있는 기반 기술로 주목받는다.
2.7 PEGylated Surfaces와 Grid Coating 전략
Cryo-EM 구조 분석에서 specimen preparation의 품질은 최종 해상도와 데이터 재현성(Reproducibility)에 결정적인 영향을 미치며, grid 표면과 단백질 간의 상호작용은 이 품질에 핵심적인 영향을 미치는 요인이다. 일반적인 carbon 또는 gold 기반 grids는 grid 표면이 소수성(Hydrophobic) 특성을 가지기 때문에 수용성 단백질이 grid 표면에 비특이적으로 흡착하거나, 심한 경우 입자가 변성, 응집, 또는 분해되는 문제가 발생할 수 있다.[10] 이를 해결하기 위한 표면 개질(Surface functionalization) 전략 중 하나로, PEG (Polyethylene glycol)를 이용한 self-assembled monolayers (SAMs) 기반의 grid 코팅 기법이 개발되었다. Meyerson et al.[36]은 holey carbon grid 표면에 thiol-PEG 화합물을 자가 조립시켜 SAM 구조를 형성하는 방법을 통해 PEGylation이 가능한 grid를 제작하였다. 이 방식은 PEG가 grid 표면에 수화된(Hydrated) 비활성층을 형성하여 단백질의 비특이적 흡착을 억제하고, AWI로부터 단백질을 물리적으로 격리시켜 입자의 안정성과 orientation distribution을 개선할 수 있다는 장점을 가진다. 이 PEG-SAM grid는 실제 cryo-EM 분석에서도 효과가 입증되었다. Particle recovery 수율이 향상되었고, preferred orientation 문제가 현저히 감소하였다. 이러한 결과는 hydration layer가 단백질이 grid 표면에 밀착되는 것을 방지하여 물리적 손상 및 aggregation을 줄이는 효과를 나타낸 것으로 해석된다. 특히 PEG 사슬의 길이 및 밀도는 흡착 억제 효과와 입자 접근성 간 trade-off 관계를 가지므로, 단백질 크기 및 구조적 특성에 따라 최적화가 필요하다.[36,37]
PEG 외에도 다양한 기능성 그룹을 갖는 SAM 기반 표면 개질 기법들이 개발되었다. 예를 들어, His-tag 단백질에 특이적인 결합을 유도할 수 있는 Ni-NTA 기능성 표면은 선택적 단백질 흡착을 유도하고, 비특이적 particle을 제거하는 효과를 가진다.[38] 이 외에도 biotin-streptavidin 결합을 활용하여 grid 표면에 target 단백질을 고정하고 orientation bias를 억제하는 전략들도 함께 개발되고 있다.
이러한 표면 엔지니어링(Surface engineering) 기술은 특히 구조적 이질성이 높은 복합체나 막단백질과 같이 다이나믹한 입자군에 대해 균질한 분석 결과를 얻는 데 유리한 조건을 제공한다. 뿐만 아니라, PEG는 electron beam 조사 시 발생하는 방사선 손상을 줄이는 데 기여할 수 있다. 수화된 PEG layer는 particle 주변의 물 분자 이동성을 유지함으로써, 방사선에 의한 결합 분해(Bond cleavage)를 완화하는 일종의 buffer 역할을 수행하며, 이로 인해 radiation damage onset을 지연시키는 효과를 유도한다.[39] 이와 같은 기능은 고선량 분할 방식(High-dose fractionation)이나 초고해상 도 이미징(Super-resolution imaging)과 같은 최신 cryo-EM 데이터 수집 전략과의 궁합 측면에서도 매우 유리한 특성을 나타낸다.
추가로, Zhao et al.[38]은 단백질의 선택적 분리를 위한 antibody-based affinity graphene oxide grid 를 제안하였다. 이는 grid 표면에 anti-tag 항체를 고정하고, 특정 epitope를 가진 단백질만을 on-grid 정제하는 방식으로, 시료의 순도와 particle visibility를 동시에 개선할 수 있는 전략이다. 이 grid는 lo w-abundance membrane protein 복합체에 특히 유리하며, on-grid purification을 통해 구조 해석 전 sample enrichment 과정을 생략할 수 있다는 장점도 제시되었다.
2.8 Nickel– Titanium 기반 Grid의 도입과 특성
Cryo-EM에서 specimen preparation 단계는 구조 해상도와 데이터 수집 효율에 직접적인 영향을 미치는 핵심 요소로 간주되며, 이에 따라 다양한 지지체 재료가 제안되고 발전되어 왔다. 최근 Amorphous nickel–titanium alloy (ANTA) film을 grid substrate로 사용하는 새로운 접근이 보고되었으며, 이는 기존의 carbon 및 gold 기반 grid가 가지는 여러 물리적 한계를 보완할 수 있는 대안으로 주목받고 있다.[40]
ANTA film은 비결정질 상태의 NiTi 합금으로 구성되며, 높은 전기 전도성과 낮은 단백질 표면 상호작용 특성을 동시에 갖는다. 이 조합은 특히 전자빔 조사 중 grid 표면에 발생하는 전하 축적을 억제하는 데 효과적이며, BIM을 감소시켜 시료의 위치 안정성과 최종 해상도를 향상시킨다. 실험적으로 ANTA grid에 human apoferritin을 로딩하여 cryo-EM 분석을 수행한 결과, 기존 carbon grid 대비 BIM이 유의미하게 감소하였으며, 더 적은 수의 micrograph만으로도 높은 해상도의 구조를 재현할 수 있었다. ANTA grid는 또한 단백질의 비특이적 흡착을 줄이는 데 효과적이다. 일반적인 탄소 필름은 소수성 특성으로 인해 수용성 단백질과의 비특이적 결합을 유도하여 입자 응집, 방향성 편향, 부분 변성 등의 문제를 유발할 수 있는데, ANTA 표면은 비교적 중성적이며 입자 흡착 친화력이 낮아 입자의 균일한 분포와 orientation bias 감소에 기여하였다. 이는 특히 복잡한 막단백질 복합체와 같은 구조적으로 민감한 샘플에서 효과적으로 작용할 수 있는 장점이다.
이러한 물리적 특성과 함께, ANTA film은 제작 공정과 응용 측면에서 기존 work flow와의 높은 호환성을 가진다. Gold grid는 복잡한 etching 또는 사전 처리(Pre-clipping)가 요구되며, 사용 시 별도 장비가 필요한 경우도 많지만, ANTA grid는 기존의 carbon grid와 동일한 방식으로 제작 및 적용이 가능하다. 따라서 AutoEM, EPU, SerialEM 등 상용 자동화된 데이터 수집 시스템과도 쉽게 통합될 수 있으며, vitrification 및 시료 분사 등 기존 specimen preparation 절차를 그대로 사용할 수 있다는 점에서 실용성이 높다. ANTA film 은 holey 구조로 가공될 수 있어 얼음막 형성 시 일관성을 유지하며, particle embedding 과정에서도 기존 cryo-EM 기술과의 호환성을 제공한다. 또한 TEM imaging 중 전하 축적에 의해 발생하는 local electric field distortion을 억제함으로써 입자의 비선형 이동 및 image blur를 감소시키며, 고해상도 reconstruction 과정에서의 분해능 저하를 방지하는 데 기여한다.
2.9 Detergent 및 Membrane Mimetic 기반 Specimen Preparation 전략
막단백질(Membrane proteins)은 세포막에 삽입된 채 존재하는 고도로 소수성인 생체분자군으로, 수용액 환경에서는 쉽게 변성되거나 응집되며, 구조적 안정성을 유지하기 어렵다. 이로 인해 cryo-EM specimen preparation에서는 grid 표면의 개질뿐만 아니라, 소수성 영역을 안정화할 수 있는 다양한 membrane mimetic system의 도입이 필수적으로 요구된다.[41,42] 가장 널리 사용되는 전략은 detergent 를 활용한 단백질의 가용화(Solubilization)이다. Detergent는 막단백질의 transmembrane 영역을 감싸며 단일 입자 상태를 유지시켜주며, 대표적으로 maltoside 계열의 n-decyl-β-D-maltoside (DM), n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), digitonin, lauryl maltose neopentyl glycol (LMNG) 등이 사용된다. 이들은 비교적 mild한 성질로 native-like 구조를 보존할 수 있으나, vitrification 과정에서 grid 표면과의 상호작용에 따라 입자의 재배열이나 응집을 유발할 수 있으며, micelle 또는 monomer가 ice 내에서 불균일하게 분포함으로써 얼음막 두께의 편차를 증가시켜 imaging 품질을 저하시킬 수 있다.[43]
이러한 detergent 기반 시스템의 한계를 극복하기 위해, 최근에는 amphipol 및 nanodisc와 같은 대체 membrane mimetic 전략이 활발히 도입되고 있다. Amphipol은 amphipathic polymer로, 막단백질의 소수성 면을 비공유 결합으로 안정화시켜 수용액 내에서 비응집 상태로 존재할 수 있도록 돕는다. Amphipol A8-35는 G protein-coupled receptor (GPCR) 및 이온 채널 등 다양한 막단백질에 적용되어, ice 내에서의 입자 생존율 증가와 angular distribution 개선 효과를 나타낸 것으로 보고되었다.[42] 또 다른 고도화된 접근법은 nanodisc 기반 재구성 방식이다. Nanodisc는 lipid bilayer를 유지한 채 막단백질을 native-like 상태로 고정할 수 있는 기술로, Membrane scaffold protein (MSP)이 리포좀 형태의 구조를 안정화시킨다. 이 방식은 AWI 노출을 줄이고, 입자의 기능적 상태를 보존하며, orientation bias를 억제하는 데 탁월한 효과를 보인다. 특히 streptavidin– biotin 상호작용을 이용해 nanodisc를 grid 표면에 고정함으로써 preferred orientation 문제를 해결한 사례도 다수 보고되었으며, 이를 통해 고해상도 구조 재현에 성공한 연구가 이어지고 있다.[42]
이러한 시스템을 사용할 경우, detergent/lipid/polymer의 최적 농도 설정이 specimen 품질에 결정적인 역할을 한다. Detergent 농도가 과도하면 얼음막 두께가 불균일해지고 입자 embedding 효율이 저하되며, 반대로 너무 낮으면 입자 변성이 유발될 수 있다. 이를 방지하기 위해 vitrification 직전 buffer 교환, gradient dilution, 또는 흡수 기반 농도 조절법이 활용된다. 특히 self-wicking nanowire grid와 병용 시 residual detergent 의 빠른 제거가 가능하며, 이로 인해 얼음막의 균일성과 시료 안정성이 동반 향상된다고 보고되었다.[31]
결론
Cryo-EM은 단백질 구조 생물학의 패러다임을 획기적으로 전환한 기술로, 직접 전자 감지기술(DED)의 도입과 함께 해상도 혁명을 주도하며, 고해상도 및 준원자 해상도 분석이 가능해졌다. 특히 X-선 결정법이나 NMR 분석이 어려운 복잡한 막단백질이나 동적 복합체에 대해 Cryo-EM은 구조 규명의 핵심 도구로 자리매김하고 있다. 하지만 이러한 기술적 진보는 단순히 검출기의 성능 향상이나 정합 알고리즘의 고도화에 의존하는 것이 아니라, specimen preparation, 특히 grid 소재의 물리⋅화학적 특성, 표면 개질 기술, 얼음막 두께 제어, 그리고 시료 안정화 전략이 통합적으로 작용한 결과이다. 본 리뷰에서는 이러한 준비 단계의 중요성과 grid 기술의 발전 과정을 중점적으로 고찰하였다.
초기의 holey carbon grid는 간단한 제작 공정과 저비용의 장점으로 널리 사용되었지만, 방사선 손상, charging artifact, 얼음막 두께의 불균일성, 그리고 AWI 노출로 인한 입자 변성 문제 등으로 인해 고해상도 구조 해석에 뚜렷한 한계를 보였다. 이를 극복하기 위해 개발된 gold grid는 전기 전도도 및 기계적 안정성이 우수하여 BIM과 정전기 축적을 효과적으로 억제할 수 있었고, ice thickness uniformity 개선을 통해 최종 해상도 확보에 결정적인 기여를 하였다.
이와 함께 단일 원자층 두께의 graphene 및 GO 기반 grid는 전자 투과율과 구조 안정성 측면에서 뛰어난 성능을 보였으며, 특히 UFG 기술은 표면 주름 및 고저차 문제를 극복하여 particle localization 및 얼음막 균일성 측면에서 최적의 조건을 제공하였다. 또한 DAG, EGS 등 고기능성 graphene 그리드는 입자의 orientation bias를 억제하고 AWI 노출을 최소화하는 새로운 지평을 열었다.
이외에도 self-wicking nano wire grid는 blotting-free 시료 준비를 가능하게 하여 shear force로부터 입자를 보호하고, radiation damage 억제, reproducibility 향상 등 다양한 이점을 제공하였으며, PEGylated surfaces 및 affinity grid 기반의 표면 개질 전략은 비특이적 흡착을 줄이고 단백질의 orientation 제어를 가능하게 하였다. ANTA grid와 같은 신소재의 도입은 BIM 억제와 표면 중립성을 통한 구조 품질 개선 가능성을 제시하였다.
한편, 단백질 자체의 안정성 확보를 위한 detergent, amphipol, nanodisc 등 membrane mimetic system의 적용은 특히 막단백질 분석에 있어 필수적인 전략으로 자리잡았으며, ice 내 입자의 생존율, orientation 다양성, 구조 보존성 측면에서 결정적인 역할을 수행하고 있다.
향후 Cryo-EM의 specimen preparation 분야는 grid 재료 혁신, 시료 준비의 자동화, 그리고 지능형 얼음 형성 제어 기술을 중심으로 통합적 발전을 이룰 것으로 전망된다. 특히 표면 개질과 nanomaterial 기술, AI 기반 조건 최적화 시스템 등이 접목될 경우, grid 선택에서부터 시료 분사, vitrification, imaging, reconstruction에 이르기까지 전체 work flow가 specimen 특성에 맞춘 형태로 진화할 것이다. 이는 단백질 구조 연구뿐만 아니라 질병 메커니즘 분석, 구조기반 신약 개발에까지 광범위하게 영향을 미치며, Cryo-EM 이 분자 생물학 및 바이오 의약학의 핵심 플랫폼으로 기능하게 할 것으로 기대된다.
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